高温灭菌法指在121℃、2标准大气压的高温高压灭菌器(压热器)中对装置进行灭菌处理的灭菌方式。如需完全清除微量移液器或加样器吸嘴的污染,高温灭菌法是最行之有效的灭菌方式。
100℃煮沸灭菌也能够有效地杀死常规灭菌方法中难以消灭的微生物、孢子及病毒。
在微生物(细菌、真菌、病毒等)相关实验中,无关微生物污染实验,将对实验结果产生影响。因此,实验中使用的微量移液器、其他实验器材及培养基等必须经过高温灭菌处理,以防止污染及交叉污染。
立洋耐高温灭菌微量移液器由耐高温灭菌材料制成,可整支反复高温灭菌,无需拆卸主体。进行高温灭菌(121℃、20分钟)时,请遵照相应型号说明书中的步骤操作。
*大容量微量移液器(1,000、5,000、10,000μL)的吸嘴吸头处装有滤芯。请务必在高温灭菌前取下滤芯。
注意,高温灭菌对耐高温的特殊微生物及RNase(核糖核酸酶)等高温下难以灭活的酶蛋白灭菌效果较差。
用立洋旗下两款可高温灭菌微量移液器(Nichipet Premium LT 与Nichipet EXⅡ)的吸嘴吸头直接吸入各100μL嗜热脂肪土芽孢杆菌,人为污染微量移液器内部。密封吸嘴处的吸头,以铝包裹整支微量移液器后,将两支微量移液器放入高压灭菌器(121℃、15分钟)中进行灭菌处理。其后,将3mL分离培养基以相同方式吸入微量移液器内部。将微量移液器排出的回收液涂抹于琼脂培养基上,观察是否有嗜热脂肪土芽孢杆菌生长。
其结果如下表所示。实验表明高压灭菌器可消灭立洋微量移液器内的嗜热脂肪土芽孢杆菌。
本研究由NPO法人生物医药科学研究组进行*。
LT | EXⅡ | 阳性对照组 (孢子培养基) |
阳性对照组中的孢子总数 | |
---|---|---|---|---|
1 | - | - | + | 2.4×107/ml |
2 | - | - | NT | NT |
3 | - | - | NT | NT |
4 | - | - | + | 2.4×107/ml |
5 | - | - | NT | NT |
6 | - | - | + | 2.3×107/ml |
7 | - | - | NT | NT |
8 | - | - | NT | NT |
9 | - | - | + | 2.1×107/ml |
10 | - | - | NT | NT |
+:已见生长。-:未见生长。NT:未实验。
1-3、4-5、6-8、9-10实验组分别采用了相同的孢子培养基。
*实验报告:“微量移液器内污染细菌的灭菌实验。”BNR 28-19 (发布于2017年1月24日)
立洋移液器的下半部分(吸嘴处)拆卸方便,重新组装简单。必要时,用户可拆卸清洗。请按照设施所在地的法律法规妥善处理产生的废液及废弃物。
处理低沸点(高挥发性)溶剂时,即使未将其误吸入移液器主体,溶剂蒸发形成的气体也依然容易进入吸嘴。建议定期信息喷嘴及移液器内部可触及部件。清洁时,应选用中性洗涤剂清洗,并使用蒸馏水彻底冲洗。冲洗后,待充分干燥,方可组装。
如曾将酸或碱吸入吸嘴,应以蒸馏水彻底冲洗喷嘴及移液器内部可触及部件。冲洗后,待充分干燥,方可组装。
如移液器主体的表面被RI污染,应使用蒸馏水、70%乙醇或中性洗涤剂将其擦拭干净。
如曾将RI吸入吸嘴,应使用蒸馏水、70%乙醇或中性洗涤剂彻底冲洗吸嘴及移液器内部可触及部件。最后,检查移液器是否存在放射性,确认放射性是否处于安全水平。
移液器被来自微生物或酶溶液的RNase污染时,如污染程度较为严重,则难以完全清除RNase污染物。大多数情况下,样品RNA降解的原因均在于内源性RNase。此处描述的方法可用于分配至RNA试验中的立洋移液器的常规清洁及污染预防工作。首先,卸下吸嘴部件,将喷嘴内侧、外侧及移液器内部部件浸泡于0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液中。接下来,对每个部件高温灭菌。该步骤将使未反应的DEPC失活。高温灭菌后干燥部件并组装。为加快干燥,建议使用由经DEPC处理或不含核酸酶的水配置的70%乙醇擦拭。
来自PCR模板的核酸污染是造成假阳性的主要原因。除定期高温灭菌外,建议使用约3%浓度的次氯酸钠擦拭吸嘴及移液器内部部件,之后使用70%乙醇除去DNA。RNA降解较快,故很少需要注意RNA。RNA降解较快,故很少需要注意RNA。
众所周知,波段在254nm前后的紫外线适用于所有微生物(包括病毒、支原体及霉菌)灭菌。本公司产品目录等内容中标有“耐紫外线”字样的立洋移液器可承受紫外线照射。紫外线照射时间因光源强度及与目标物间距离而异。我司移液器灭菌时,在超净台上用灭菌灯照射30~60分钟即可。
但由于紫外线无法照射到微量移液器内部,因此使用此方法对内部部件进行灭菌处理时,请拆开吸嘴处,将内部部件暴露在紫外线下。(O型圈与密封圈不耐紫外线,建议使用其他方法清洁。)
此外,还可以选择采用EOG(环氧乙烷气体)等的气体灭菌法,以及使用伽马射线或电子束的灭菌法,但这些方法投入的人力、成本及设备并不适用于用户的日常污染清除作业。故从前述内容中选择合适的方法,足以去除并防止立洋移液器受到日常污染。综上,RNA实验及RI实验应专门分配微量移液器,不可与细胞培养或细菌培养共用。
另外,PCR中一定要准备阴性对照。
缜密操作是检查和防止样品交叉污染中最行之有效的方法。
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